| 角色 | 饰演者 | 角色介绍 |
| Peter Parker / Spider-Man | 安德鲁·加菲尔德 | |
| Gwen Stacy | 艾玛·斯通 | |
| Dr. Curt Connors / The Lizard | 瑞斯·伊凡斯 | |
| Ben Parker | 马丁·辛 | |
| Mary Parker | 艾伯丝·戴维兹 | |
| May Parker | 莎莉·菲尔德 | |
| Flash Thompson | 克里斯·泽尔卡 | |
| George Stacy | 丹尼斯·利瑞 | |
| Ray | C·托马斯·豪威尔 | |
| Mrs. Van Adder | 安妮·帕里西 | |
| Richard Parker | 坎贝尔·斯科特 | |
| Sally Avril | 凯尔西·周 | |
| Stan the Librarian | 斯坦·李 | |
| Nels Van Adder / Proto-Goblin | 伊尔凡·可汗 | |
| Ariel | 安珀·史蒂芬斯 | |
| David Lowell | 迈克尔·马西 | |
| Missy Kallenback | 汉娜·马克斯 | |
| Howard Stacy | 斯凯勒·吉桑多 | |
| Miss Ritter | 芭芭拉·伊芙·哈里斯 | |
| Peter Parker - age 7 | 麦克斯·查尔斯 | |
| Helen Stacy | 卡丽·科尔曼 | |
| Billy Connors | 迈尔斯·艾略特 | |
| Oscorp Intern (as Hannah Pitts) | 汉娜·劳埃德 | |
| Angelo Fincelli | 帕特里克·艾伦·戴维斯 | |
| Glasses | 雷夫·甘特沃特 | |
| Philip Stacy | 查理·德皮尤 | |
| Lab Tech #2 | 艾瑞克·斯尔沃 | |
| Sharisse | Andrea Sixtos | |
| Jack | 杰克·凯弗 | |
| Simon Stacy | 雅各布·罗迪尔 | |
| Tina | 莫利·摩根 | |
| SWAT Officer (uncredited) | 亚历山大·贝特里 | |
| Scientist (uncredited) | 马克斯·博格纳 | |
| Customs House Pedestrian (uncredited) | 蒂娜·柏德 | |
| Freckled Kid (uncredited) | 马克·多尔蒂 | |
| Scientist (uncredited) | 肯·爱德林 | |
| Lab Technician (uncredited) | 杰佛瑞·福克斯 | |
| Tough Guy #4 - Subway (uncredited) | 拜伦·弗莱迪 | |
| Construction Worker (uncredited) | Shashawnee Hall |
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